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Q1、做細(xì)胞信號傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
A1：對二抗無要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。

Q2、同一公司的不同抗體用某個(gè)稀釋度對一種抗體效果好，另外一種抗體可不可以用同種稀釋度進(jìn)行稀釋？
A2：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)摸索。

Q3、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
A3：免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表位)，有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。

Q4、Western Blot 中抗體的重復(fù)應(yīng)用問題
A4：抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4℃保存，避免反復(fù)凍融。

Q5、做western每次只加一種一抗，可以同時(shí)加兩種或者多種一抗的嗎？
A5：最好還是不要同時(shí)加兩種一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。