二抗在免疫學(xué)實驗中起著舉足輕重的作用,二抗的選擇也決定了整個實驗的成敗。實驗中在選擇二抗時必須注意以下幾點:
(1)一抗種屬來源
主要根據(jù)一抗種屬來源來決定確定二抗的類型,如一抗是小鼠來源,那二抗就買抗小鼠的即可(如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可)。
(2)一抗類型
二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。
單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當是抗小鼠IgM。
如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合,或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以選擇抗IgG1的二抗,此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。
在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下,可以選用抗相應(yīng)物種IgG。
(3)標記物的選擇
一般來講,耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),熒光基團(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA,常用的二抗是酶標二抗,而細胞或組織標記實驗(細胞免疫化學(xué),組織免疫化學(xué),流式細胞術(shù))中通常使用熒光基團標記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號,可以使用biotin/avidin檢測系統(tǒng)。
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